高效液相色譜法檢測(cè)飼料中孔雀石綠的方法

孔雀石綠（malachitegreen）又稱(chēng)為苯胺綠、維多利亞綠或中國(guó)(China)綠，是一種具有金屬光澤的綠色晶體?？兹甘G的化學(xué)官能團(tuán)三苯沼氣(CH4)是一種致癌物資，且其易在魚(yú)體內(nèi)和情況中殘留，存在致突變、致畸和致癌的危險(xiǎn)，故我國(guó)、美國(guó)(United States)、加拿大(Canada)以及歐盟等很多國(guó)度均制止其在經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)（觀賞魚(yú)除外）和人類(lèi)食用魚(yú)中應(yīng)用。魚(yú)粉是飼猜中動(dòng)物卵白的重要起源，含有孔雀石綠及其代謝物的魚(yú)粉添加到飼猜中可經(jīng)由進(jìn)程食品鏈要挾到人類(lèi)健康。
    我所現(xiàn)采用NY/T 1756-2009標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用深圳普分科技有限公司高效液相色譜法（HPLC）對(duì)飼料中孔雀石綠進(jìn)行測(cè)定，本標(biāo)準(zhǔn)適用于配合飼料、濃縮飼料、添加劑預(yù)混合飼料、魚(yú)粉中孔雀石綠和無(wú)色孔雀石綠含量的測(cè)定。液相色譜法孔雀石綠和無(wú)色孔雀石綠的定量限均為 10μg/kg；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的定量限均為 1.0 μg/kg?，F(xiàn)將該方法簡(jiǎn)要介紹如下：
    1.原理 以乙腈-乙酸鈉緩沖溶液提取樣品中的孔雀石綠和無(wú)色孔雀石綠，提取液經(jīng)過(guò)二氯甲烷液液萃取，再經(jīng)固相萃取柱凈化，用接有二氧化鉛柱的氰基柱進(jìn)行高效液相色譜分離，紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量。
    2. 分析步驟
    2.1 提取 稱(chēng)取飼料樣品約 5g (**到 0.001g) ，置于100ml離心管中，依次加入1.5ml鹽酸羥胺溶液、2ml對(duì)甲苯磺酸溶液、5ml乙酸鈉緩沖溶液和 20 ml乙腈，加入約2g 酸性氧化鋁，振蕩2min，超聲30 min，4 000 r/min 離心5 min。將上清液轉(zhuǎn)移至250 ml分液漏斗中，向離心管中再次加入20 ml乙腈，振搖2 min，4000 r/min 離心5 min，合并上清液至分液漏斗中。 
    2.2 液液萃取 加入50ml氯化鈉溶液、50ml二氯甲烷，旋搖，靜置分層。用蒸發(fā)瓶收集下層液體后，在分液漏斗再次加入 20ml二氯甲烷，旋搖，靜置分層，收集下層液體于同一蒸發(fā)瓶。將收集液35℃下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(注意：開(kāi)始時(shí)溫度不要直接升35℃，以免爆沸)至近干，加入5 ml，乙腈溶解殘?jiān)瑐溆谩?
    2.3 凈化
    2.3.1 固相萃取柱的活化 按中性氧化鋁柱在上、PRS 柱在下的順序?qū)芍?lián)，使用前用 5ml乙腈預(yù)洗兩柱。
    2.3.2上樣 將2.3.1的樣液緩慢轉(zhuǎn)移到中性氧化鋁柱內(nèi),在抽真空情況下過(guò)柱(保持流速 1 ml／min) 。再用5ml乙腈洗滌蒸發(fā)瓶2次，洗滌液均轉(zhuǎn)移至柱內(nèi)，*后用 5 ml乙腈洗滌小柱。
    2.3.3洗脫收集 棄去中性氧化鋁柱，用乙腈-乙酸鈉緩沖溶液2ml、鹽酸羥胺甲醇溶液lml洗脫，收集洗脫液，過(guò)膜(孔徑 0.45μm)，上機(jī)測(cè)定。
    2.4樣品測(cè)定
    2.4.1色譜條件 
    色譜柱：氰基柱，250 mm ×4.6 mm，柱后氧化鉛柱：35 mm×4.6 mm。 流動(dòng)相：乙腈＋乙酸鈉緩沖溶液＝60＋40 (v＋v) ；
    流速：1.0 ml/min 。 
    柱溫：室溫。 
    進(jìn)樣量：50 μl。 
    檢測(cè)波長(zhǎng)：600 nm。
    2.4.2定量測(cè)定 按高效液相色譜儀說(shuō)明書(shū)調(diào)整儀器操作參數(shù)。向液相色譜儀中注入孔雀石綠和無(wú)色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)工作液及試樣溶液，得到色譜峰面積響應(yīng)值，用外標(biāo)法定量。

1 氯霉素類(lèi)**概述
氯霉素類(lèi)**是應(yīng)用廣泛的廣譜***，常用于動(dòng)物各種傳染性**的**中，對(duì)各類(lèi)家禽、家畜、水產(chǎn)品及蜂蜜制品各種傳染性**的控制和**起重要作用。氯霉素*初是從委內(nèi)瑞拉鏈絲菌的培養(yǎng)液中提取制得，現(xiàn)在基本使用化學(xué)合成法大量生產(chǎn)。其性質(zhì)穩(wěn)定，在干燥狀態(tài)下可保存藥效達(dá)2年以上，易溶于有機(jī)溶劑，25 ℃時(shí)100 ml水中僅溶解25 mg。水溶液呈中性，在酸性和中性溶液中較穩(wěn)定，遇堿類(lèi)易分解失效。其合成品具有**光性，也稱(chēng)左霉素。
2 氯霉素殘留對(duì)人類(lèi)健康的危害
2.1 骨髓造血機(jī)能紊亂
氯霉素對(duì)骨髓造血機(jī)能有抑制作用，可引起血小板減少性紫癜、粒細(xì)胞缺乏癥、再生障礙性貧血、溶血性等，多數(shù)在長(zhǎng)期或多次用藥的過(guò)程中發(fā)生。
2.2 對(duì)早產(chǎn)兒和新生兒的毒性
在早產(chǎn)兒和新生兒肝內(nèi)有些酶系統(tǒng)發(fā)育尚不完全，葡萄糖醛酸結(jié)合的能力較差，因此影響氯霉素在肝中的**作用；此外，腎臟排泄能力亦較弱，能招致**蓄積中毒。
2.3 胃腸道癥狀、口部癥狀
胃腸道反應(yīng)主要有腹脹、腹瀉、食欲減退，惡心、嘔吐則少見(jiàn)?？诓堪Y狀如口腔粘膜充血、疼痛、糜爛、口角炎和舌炎等。
2.4 其它**反應(yīng)
可引起視神經(jīng)炎、視力障礙、多發(fā)性神經(jīng)炎、神經(jīng)性耳聾以及嚴(yán)重**。有時(shí)發(fā)生中毒性精神病，主要表現(xiàn)為幻視、幻聽(tīng)、定向力喪失、精神失常等。
3 氯霉素殘留對(duì)我國(guó)動(dòng)物產(chǎn)品出口的影響
氯霉素殘留問(wèn)題已引起國(guó)際組織和世界上許多國(guó)家和地區(qū)的高度重視。歐盟、美國(guó)等均在法規(guī)中規(guī)定氯霉素殘留限量標(biāo)準(zhǔn)為“零容許量”，即不得檢出。
幾年來(lái)，我國(guó)出口到歐盟、美國(guó)等地區(qū)的水產(chǎn)品、蜂蜜等多次因?yàn)槁让顾爻瑯?biāo)被限制，損失達(dá)到數(shù)十億美元。
4 氯霉素殘留檢測(cè)方法
近年來(lái)各種關(guān)于氯霉素殘留的檢測(cè)方法不斷涌現(xiàn)，大致可分為三大類(lèi)：**類(lèi)是生物測(cè)定法，**類(lèi)是理化分析法，第三類(lèi)是兼有生物和化學(xué)的酶聯(lián)**檢測(cè)法。
4.1 篩選檢驗(yàn)方法
在實(shí)際工作中，不可能也沒(méi)必要對(duì)所有動(dòng)物性水產(chǎn)品進(jìn)行各種復(fù)雜、昂貴且耗時(shí)的分析檢測(cè)。為能快速確定動(dòng)物食品中是否有氯霉素殘留，通常做法是遵循一定程序，對(duì)被測(cè)產(chǎn)品進(jìn)行取樣，按規(guī)范要求對(duì)樣品進(jìn)行篩選檢驗(yàn)，對(duì)篩選為陽(yáng)性的樣品再用更**的方法進(jìn)行定量鑒定。
4.1.1 微生物法
在快速篩選檢驗(yàn)程序中，微生物法非常有效，這類(lèi)方法簡(jiǎn)單、費(fèi)用少、速度快，因而廣泛用于動(dòng)物性食品獸藥殘留的初篩。
4.1.1.1 棉簽法
棉簽法又稱(chēng)現(xiàn)場(chǎng)拭子法，是檢測(cè)動(dòng)物體中***殘留的現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)方法。
該方法是用棉簽（拭子）采取動(dòng)物體內(nèi)的組織液，然后將其放置于涂滿(mǎn)枯草桿菌的培養(yǎng)基中保溫過(guò)夜。觀察是否在拭子周?chē)霈F(xiàn)抑菌環(huán)，若有，即表明組織液中有***存在。如果該動(dòng)物僅用氯霉素進(jìn)行過(guò)**，則可以認(rèn)為該組織中存在氯霉素殘留。此方法在幾分鐘內(nèi)即可完成取樣操作，16～18 h即可獲得結(jié)果，是簡(jiǎn)便易行而又有一定準(zhǔn)確性的檢測(cè)方法，比較適合基層現(xiàn)場(chǎng)篩選檢測(cè)。但是該檢測(cè)法靈敏度較差，檢出限較高，多在μg/g級(jí)，特異性差，一般***類(lèi)**都有此類(lèi)反應(yīng)，而且不能定量。
4.1.1.2 杯碟法
樣品經(jīng)處理后，注入牛津杯中，與含菌液的檢定平板貼合，培養(yǎng)后，根據(jù)抑菌圈有無(wú)及大小判定結(jié)果。采用不同的試驗(yàn)菌種，可檢測(cè)不同的***。此法檢出限為0.25 μg/g。
這種方法與棉簽法相比，靈敏度高，能夠排除一定的干擾，但要進(jìn)一步提高靈敏度很困難。
4.1.2 **分析方法
**分析是以抗原與抗體的特異性、可逆性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的新型分析技術(shù)。**反應(yīng)具有很高的選擇性和靈敏性，因此，**分析技術(shù)無(wú)論作為獸藥殘留分析的檢測(cè)手段還是樣本凈化方法都能使分析過(guò)程特別是前處理步驟大大簡(jiǎn)化。作為相對(duì)獨(dú)立的檢測(cè)方法，即基于競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析原理的**測(cè)定法，包括酶聯(lián)**吸附測(cè)定（ELISA）、放射**測(cè)定（RIA）、固相**傳感器等。
目前使用*普遍的酶聯(lián)**法（ELISA），具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、樣品容量大、儀器化程度和分析成本低的優(yōu)點(diǎn)，是目前*理想的殘留篩選性分析方法之一。
ELISA是基于抗原和抗體反應(yīng)而建立的。由于氯霉素是半抗原，不能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。要使半抗原性物質(zhì)具有**原性,就需使其與大分子載體物質(zhì)(蛋白質(zhì))相結(jié)合制備人工抗原,而后將其作為抗原進(jìn)行使用,動(dòng)物體內(nèi)即可產(chǎn)生相應(yīng)特異性的抗氯霉素的抗體,在此基礎(chǔ)上建立酶聯(lián)**競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定氯霉素含量。
此種方法靈敏度高，檢測(cè)下限可達(dá)0.05 μg/kg，重現(xiàn)性好，回收率高，在1 μg/kg的添加水平下，回收率可達(dá)107%～113%。
酶聯(lián)**法的缺點(diǎn)在于影響因素較多,易出現(xiàn)大量假陽(yáng)性結(jié)果;抗體批次不同,測(cè)定結(jié)果也會(huì)出現(xiàn)差異。
4.2 定量確認(rèn)方法
4.2.1 高效液相色譜法
高效液相色譜法檢測(cè)氯霉素是一種靈敏度較高、可靠性較強(qiáng)的一種方法，此法重復(fù)性好、假陽(yáng)性少，可以進(jìn)行定量鑒定，但檢出限較高，為5～10 μg/kg，回收率偏低。因?yàn)閯?dòng)物體內(nèi)成分復(fù)雜，一些雜質(zhì)干擾測(cè)定，應(yīng)用該法檢測(cè)時(shí)，對(duì)于樣品預(yù)處理必須仔細(xì)謹(jǐn)慎，以提高測(cè)定準(zhǔn)確性和靈敏度。
4.2.2 氣相色譜法
目前較常用的氯霉素確證方法是氣相色譜法,該方法的特點(diǎn)是高分離效能、高選擇性、高靈敏度、檢出限低、快速、應(yīng)用廣,還可用于制備高純物質(zhì)。它可以對(duì)于分配系數(shù)相差很近的組分進(jìn)行分離,從而分離出極為復(fù)雜的混合物。檢出限一般為μg/kg級(jí),常用于*****殘留的檢測(cè)。但是大多數(shù)獸藥極性或沸點(diǎn)偏高,需繁瑣的衍生化步聚,因而限制了氣相色譜法的應(yīng)用。
飼料中氯霉素含量的檢測(cè)目前采用氣相色譜法。該方法先將配合飼料用乙酸乙酯提取，取部分提取液用氮?dú)獯等ヒ宜嵋阴ズ螅瑲堅(jiān)眉状?/span>/氯化鈉溶液溶解，用正己烷液－液萃取除去油脂及脂溶物，氯霉素再用乙酸乙酯提取、吹干，C18小柱凈化，經(jīng)衍生劑衍生后用配有電子捕獲檢測(cè)器的氣相色譜檢測(cè)。氣相色譜條件如下。
載氣：氮?dú)?/span>1.5 ml/min；補(bǔ)充氣：氮?dú)?/span>25 ml/min；分流比：1：10。溫度：氣化室280 ℃；檢測(cè)器300 ℃；柱箱230 ℃。
在上述儀器條件下，注入標(biāo)準(zhǔn)工作液1 μl，調(diào)整試樣定容體積使試樣溶液中氯霉素的峰值與標(biāo)準(zhǔn)工作液中氯霉素峰值相近，以保留時(shí)間和峰值的比較對(duì)氯霉素進(jìn)行定量計(jì)算。重復(fù)性：兩個(gè)平行測(cè)定的結(jié)果相對(duì)偏差不得大于5％?；厥章剩禾砑恿吭?/span>0.01 mg/kg時(shí)，回收率在90%~105%。該方法的*低檢出限為0.005 mg/kg。
5 結(jié)論
總的來(lái)說(shuō)，基于抗原抗體特異性反應(yīng)建立起來(lái)的**學(xué)測(cè)定方法靈敏度較高，特異性強(qiáng)，試樣預(yù)處理簡(jiǎn)單，分析時(shí)間短。近幾年酶聯(lián)**法得到了很大的發(fā)展,假陽(yáng)性率明顯降低,而且適應(yīng)廣泛。目前在肉類(lèi)、魚(yú)蝦、蛋品、尿液、血清、牛奶、蜂蜜及飼料中都用酶聯(lián)**法來(lái)做氯霉素檢測(cè)的篩選。
國(guó)際上公認(rèn)的定量確認(rèn)方法仍是理化分析法，主要是氣相色譜法和液相色譜法，這兩種方法靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，假陽(yáng)性少，缺點(diǎn)是樣品前處理過(guò)程復(fù)雜、儀器化程度高且價(jià)格昂貴，分析速度慢。二者相比較，由于HPLC檢出限較高，已逐漸不能滿(mǎn)足發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)檢測(cè)方法檢出限的要求。聯(lián)用技術(shù)出現(xiàn)后，LC-MS由于靈敏度高,檢出限更低,結(jié)果**可靠,在氯霉素殘留的分析中正逐漸代替單一的色譜技術(shù)。